Jako odczynniki wtórne zastosowano streptawidynę skoniugowaną z izotiocyjanianem fluoresceiny (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pa.) Lub Tricolor (Caltag); i osioł przeciwgrubny IgG skoniugowany z izotiocyjanianem fluoresceiny lub fikoerytryną (Jackson ImmunoResearch). Podwójnie ujemne komórki T wykrywano przez trzykolorowe barwienie przeciwciałami monoklonalnymi anty-CD3, anty-CD8 i anty-CD4. Hodowla komórkowa i analiza funkcji Fas i Fas-Ligand
Komórki T aktywowano przeciwciałem monoklonalnym anty-CD3 OKT3 (płyn puchlinowy, rozcieńczenie 1: 1000) i interleukiną-2 (20 U na mililitr) przez siedem do ośmiu dni przed testami. Aby zbadać funkcję Fas, aktywowane komórki T inkubowano z IgG3 anty-APO-18 (dostarczonym przez Petera Krammera, Niemiecki Instytut Badawczy Raka, Heidelberg, Niemcy) lub kontrolnym przeciwciałem monoklonalnym przez 16 godzin, 7 i żywotność komórek zmierzono test Alamar Blue. Funkcja liganda Fas oceniano za pomocą testu uwalniania chromu, z aktywowanymi komórkami T (> 95 procent CD3 +) i komórkami docelowymi składającymi się z mysiej linii komórkowej chłoniaka z limfocytów B L1210, transfekowanych mysim Fas w orientacjach sensownych lub antysensownych (uprzejmie dostarczone przez W. Clarke, UCLA, Los Angeles) .9 Komórki efektorowe inkubowano z celami znakowanymi chromem-51 przez sześć godzin w obecności anty-CD3, a zakres swoistej lizy został obliczony.6 Test przeprowadzono również w obecności magnezowego kwasu etylenoglikolo- bis- (.-aminoetylo) -N, N, N , N -tetraoctowego w celu blokowania zależnej od wapnia cytotoksyczności z udziałem perforyny, jak opisano w innym miejscu. .10
Sekwencja nukleotydowa DNA Fas i Fas-liganda i analiza polimorfizmów jednoniciowych konformacji
Tabela 1. Tabela 1. Startery oligonukleotydowe stosowane w badaniach genów Fas i FasL. Komplementarny DNA (cDNA) wytworzono z komórek T aktywowanych anty-CD3, 11 i sekwencje genowe Fas i Fas-ligand (FasL) zamplifikowano z reakcją łańcuchową polimerazy (PCR) przez startery12,13 przedstawione w Tabeli 1. Dla Fas fragment 5 cDNA o długości 694 bp, obejmujące sekwencje kodujące zewnątrzkomórkowe i transbłonowe domeny (para primerów i 14 w Tabeli 1) i fragment cDNA o długości 506 pz, kodujący domeny transbłonowe i cytoplazmatyczne (primery 11 i 4). w Tabeli 1) zostały wygenerowane. Produkty PCR klonowano do pGEM-T (Promega, Madison, Wis.), A dwukierunkowe sekwencjonowanie wstawek przeprowadzono z konsensusowymi starterami T7 i Sp6. Wyniki zostały zebrane zgodnie z zaleceniami zestawu gotowych zestawów do sekwencjonowania Prism Dye Terminator Cycle Sequencing (Perkin Elmer, Foster City, CA) i przeanalizowane za pomocą automatycznego sekwencera (model 377, ABI, Foster City, CA).
W celu weryfikacji mutacji wyizolowano genomowy DNA z leukocytów krwi obwodowej.14 Do 100 ng DNA użyto jako matrycy w 100-.l reakcji PCR (denaturacja w 95 ° C przez jedną minutę, przyłączanie w 55 do 60 ° C przez jedną minutę i wydłużanie w 72 ° C przez jedną do dwóch minut) przez 30 cykli. Produkty PCR sekwencjonowano bezpośrednio starterami znakowanymi końcowo [.32P] ATP (układ sekwencjonowania cyklicznego fmol DNA, Promega). W przypadku Pacjenta 2, materiał archiwalny był dostępny z jego próbki biopsji wątroby (uprzejmie dostarczone przez dr
[więcej w: diltiazem, atropina, buprenorfina ]
[patrz też: kaszel krtaniowy u dorosłych, kątnica jelita, kiretaż zamknięty ]
